روش های مختلف جداسازی باکتری ها از نمونه اولیه

بسیاری از نمونه های مورد مطالعه حاوی تعداد بیشماری از باکتری های گوناگون هستند . به همین دلیل پس از کشت روی سطح محیط جامد باکتری ها به صورت یک توده انبوه یک دست رشد می نمایند و کلنی های مخصوص ایجاد می کنند که شناسایی تک آن ها امکان پذیر نمی باشدبنابر این زمانی که مقدار باکتری به محیط کشت اضافه می شود ، بایستی روشی اتخاذ گردد که تعداد باکتری ها را تقلیل داد و آنها را به نحوی پخش کرد که با فاصله کافی و جدا از هم قرار گیرند تا پس از رشد کلنی های تک و خالصی را بر روی سطح محیط کشت ایجاد کنند این کار با سه روش مختلف امکان پذیر می باشد :

1. Pour plate
2. Spread plate
3. Streak plate

روش Pour plate  :

برای تهیه محیط های این نوع کشت باید از محیط های آگار ( جامد ) استفاده نمود . در این روش مقدار مشخصی از باکتری برداشته شده از محیط کشت مایع را در چند مرحله رقیق می کنیم تا تعداد باکتری های موجود در آن به اندازه ای کم شود که بتوان بر روی محیط کشت کلنی ها ی تک ایجاد نمود .

در این روش قبل از سفت شدن محیط جامد ، حجم مشخصی از باکتری را بر آن اضافه و محیط را در پلیت استریل می ریزیم . محیط کشت پس از سرد شدن بسته شده و باکتری به طور یکنواخت ، درون محیط پخش می شوند و پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد و مدت زمان 24 ساعت کلنی های باکتری در همه جای محیط حتی در عمق آن نیز پخش می شوند . کاربرد این روش بیشتر برای شمارش باکتری ها می باشد و در میکروبیولوژی مواد غذایی کاربرد دارد .

بااین روش باکتریهایی که میکروآئروفیل ( بی هوازی اختیاری ) هستند ، قابل جداسازی می باشند . از اشکالات این روش آن است که مواد و وسایل زیادی مصرف شده و به علاوه وقت گیر و دشتوار است .

روش Spread plate  :

این روش مشابه روش Poure plate بوده و می توان برای شمارش و جداسازی باکتری ها مورد استفاده قرار گیرد و تا حدودی از قبل ساده تر می باشد . در این روش نیز بایستی از نمونه اولیه ، رقت های متوالی تهیه کنید ( رقت در محیط مایع تهیه می گردند ) سپس 0.1ml از هر رقت را روی سطح پلیت های حاوی نوتریت آگار ریخته و با کمک یک میله شیشه ای آن را در تمام سطح پلیت پخش کنید .

در این روش باکتری هایی که در سطح پلیت پخش شده اند ، ایجاد کلنی تک می کنند و مطابق روش قبل می توان تعداد کلنی های هر یک از پلیت ها را شمارش نمود و چون تعداد کلنی های شمارش شده مربوط به حجم مشخصی از نمونه تلقیح شده می باشد با در نظر گرفتن ضریب رقت ، می توان تعداد کلنی های موجود در نمونه اولیه را محاسبه نمود .

روش Streak plate  :

روش Streak plate یکی دیگر از روش های جداسازی باکتری ها می باشد . این روش از روش های قبل ساده تر و اقتصادی تر بوده و مراحل جداسازی باکتری فقط روی یک پلیت صورت می گیرد و زمان کمتری را به خود اختصاص می دهد . لذا روشی است که به طور معمول در آزمایشگاه انجام می گیرد . باید توجه داشت که در این روش نمی توان تعداد باکتری های موجود در نمونه را شمارش کرد .

در روش Streak cluture ارگانیزم هایی که به وسیله سوآب از شخص بیمار گرفته شده بر روی قسمتی از پلیت ( یک سوم فوقانی پلیت ) منتقل می گردد و با کمک لوپ با کشیدن خطوطی بر روی سطح پلیت بر طبق اصول خاص ، پخش می شود که در این صورت باکتری ها با فاصله مناسب از یکدیگر جدا می شوند تا پس از تگثیر به صورت کلنی های تک بر روی سطح محیط کشت ظاهر شوند . برای Streaking روش های متفاوتی وجود دارد که در شکل چند نمونه آن به تصویر کشیده شده است .

معمول ترین روش و شاید بهترین در کشت خطی روش quadrant streak method می باشد که در تصویر به صورت شماتیک نشان داده شده است .